Nejvnitřnější místnost ve svatostánku a později v chrámu; říkalo se jí také Svatá svatých. (2Mo 26:33, Rbi8, ppč; 1Kr 6:16) Toto oddělení svatostánku mělo zjevně tvar krychle, přičemž každý z jeho tří rozměrů měřil deset loket (4,5 m). Rozměry Nejsvětější byly v chrámu vystavěném Šalomounem dvakrát větší než ve svatostánku; její objem byl tedy osminásobný. (2Mo 26:15, 16, 18, 22, 23; 1Kr 6:16, 17, 20; 2Pa 3:8)

Do Nejsvětější vstupoval velekněz pouze jednou za rok v Den smíření; nikdo jiný nemohl nikdy vstoupit za oponu, která visela mezi touto místností a Svatou. (3Mo 16:2) V Nejsvětější byl velekněz obklopen barevnými cherubíny vyšitými na vnitřních látkách svatostánku a na oponě. (2Mo 26:1, 31, 33) V Šalomounově chrámu byly stěny a strop vyrobeny z cedrového dřeva, které bylo potaženo zlatem. Na stěnách byly řezby cherubínů, palem, tykvovitých ozdob a květin. (1Kr 6:16–18, 29; 2Pa 3:7, 8)

Písmo ukazuje, že v Den smíření vstupoval velekněz do Nejsvětější třikrát: poprvé se zlatou kadidelnicí a vonným kadidlem, které zapálil pomocí uhlíků z oltáře; podruhé s krví býka, který byl obětí za hřích kněžského kmene; a nakonec potřetí s krví kozla, který byl obětí za hřích lidu. (3Mo 16:11–15; Heb 9:6, 7, 25) Krví zvířat pokropil zem před truhlou smlouvy, na jejímž víku byli zlatí cherubíni. Nad víkem byl navíc oblak, který symbolizoval Jehovovu přítomnost. (2Mo 25:17–22; 3Mo 16:2, 14, 15) Tento oblak zřejmě zářil jako jasné světlo a byl jediným osvětlením pro toto oddělení svatostánku, v němž nebyl žádný svícen.

Dokud byl svatostánek v pustině, přebýval nad Nejsvětější ve dne oblak a v noci ohnivý sloup, které byly viditelné celému táboru Izraele. (2Mo 13:22; 40:38; 4Mo 9:15; srovnej Ža 80:1.)

Žádná Truhla v pozdějších chrámech. Kdy přesně a za jakých okolností truhla smlouvy zmizela, není známo. Je zřejmé, že ji neukořistili Babylóňané, když v roce 607 př. n. l. vyplenili a zničili chrám, protože Truhla není uvedena mezi chrámovými předměty, které odnesli s sebou. (2Kr 25:13–17; Ezra 1:7–11) Ve druhém chrámu postaveném Zerubbabelem a v honosnějším Herodově chrámu v Nejsvětější žádná Truhla nebyla. Když zemřel Ježíš, projevil Bůh svůj hněv tím, že způsobil, aby se silná, těžká opona, která oddělovala Nejsvětější od Svaté, odshora až dolů roztrhla vedví. Kněží, kteří tehdy vykonávali svou práci ve Svaté, mohli vidět dovnitř Nejsvětější, a mohli se tedy přesvědčit o skutečnosti, že v tomto oddělení není žádná Truhla, která by znázorňovala Boží přítomnost mezi nimi. Tímto skutkem Bůh potvrdil, že usmiřující oběti předkládané židovským veleknězem jsou od nynějška bezcenné a že služby levitského kněžstva již nejsou zapotřebí. (Mt 27:51; 23:38; Heb 9:1–15)

Symbolické použití. Uvnitř Nejsvětějšího oddělení stanu setkání neboli svatostánku byla truhla smlouvy. Víko této Truhly, které bylo ozdobeno dvěma zlatými cherubíny, představovalo Boží trůn. Proto Nejsvětější obrazně představovala bydliště neboli místo přebývání Jehovy Boha, totiž samotné nebe. Inspirovaný dopis Hebrejcům nám tyto záležitosti vysvětluje, když srovnává vstoupení izraelského velekněze do Nejsvětější jednou za rok v Den smíření se vstupem  velkého Velekněze Ježíše Krista do toho místa, které Nejsvětější znázorňovala. Vstoupil tam jednou provždy s obětí za hříchy. Je zde vysvětleno: „Do druhého oddělení [Nejsvětější] vstupuje pouze sám velekněz jednou za rok, ne bez krve, kterou obětuje sám za sebe a za hříchy lidu z nevědomosti. . . . Právě tento stan je podobenstvím pro ustanovený čas, který je nyní zde . . . Když však Kristus jako velekněz dobrých věcí, které nastaly, přišel skrze větší a dokonalejší stan, ne udělaný rukama, totiž ne z tohoto stvoření, nevstoupil s krví kozlů a mladých býků, nýbrž se svou vlastní krví jednou provždy do svatého místa a obdržel pro nás věčné osvobození. Proto bylo nutné, aby předobrazná znázornění věcí v nebesích byla očištěna těmito prostředky [krví obětních zvířat, kterou byla pokropena], ale samotné nebeské věci oběťmi, které jsou lepší než takové oběti. Vždyť Kristus nevstoupil do svatého místa udělaného rukama, které je napodobením skutečnosti, ale do samotného nebe, aby se nyní za nás objevil před osobou Boha.“ (Heb 9:7–12, 23, 24)

Tak Ježíš jako velký Velekněz podle způsobu Melchisedeka naplnil to, co mohl izraelský velekněz z Áronovy rodové linie, když vcházel do pozemské Nejsvětější, udělat pouze symbolicky. (Heb 9:24) Tentýž dopis Hebrejcům posiluje Kristovy duchovní bratry a spoludědice slovy: „Abychom . . . my, kteří jsme uprchli do útočiště, měli silné povzbuzení, abychom se chopili naděje, která je nám předložena. Tuto naději máme jako kotvu pro duši, jistou i pevnou, a ta vstupuje dovnitř za oponu, kam za nás vstoupil předchůdce, Ježíš, jenž se stal navždy veleknězem podle způsobu Melchisedeka.“ (Heb 6:18–20)

Pavel následujícími slovy opět povzbuzoval tyto křesťany, aby cítili naprostou volnost a důvěru, když se přibližují k Bohu, a aby se pevně a bez kolísání drželi své naděje. Napsal jim: „Bratři, protože tedy máme smělost, pokud jde o vstupní cestu do svatého místa prostřednictvím Ježíšovy krve, kterou pro nás zasvětil jako novou a živou cestu skrze oponu, totiž své tělo, a protože máme velkého kněze nad Božím domem, přibližujme se s pravým srdcem v plné jistotě víry, když máme své srdce očištěno pokropením od ničemného svědomí a své tělo vykoupáno čistou vodou. Pevně se bez kolísání držme veřejného prohlašování své naděje, protože je věrný ten, kdo dal slib.“ (Heb 10:19–23)