Eftersom Erasmus mestrede både græsk og latin, kunne han sammenligne latinske bibeloversættelser (som for eksempel Vulgata) med tidlige græske håndskrifter af De Kristne Græske Skrifter, almindeligvis kendt som Det Nye Testamente. Han blev overbevist om at bibelkundskab var altafgørende. Derfor mente han at De Hellige Skrifter skulle oversættes til sprog der blev brugt på hans tid.

Erasmus var fortaler for at den katolske kirke skulle fornys indefra, for ifølge ham burde det at være kristen ikke blot handle om meningsløse ritualer, men være en livsstil. Da reformatorerne begyndte at gøre oprør og forlange forandringer inden for den katolske kirke, kom han derfor i kirkens søgelys.

I sine værker udstillede Erasmus på en satirisk måde præsters magtmisbrug og overdådige livsstil samt ærgerrige pavers blåstempling af krige. Han tog stærkt afstand fra korrupte gejstlige, der gennem kirkelige traditioner – såsom at skrifte, at tilbede helgener, at faste og at foretage pilgrimsrejser – udnyttede kirkens medlemmer. Erasmus var også imod afladshandel og kravet om cølibat.

I 1516 udgav Erasmus sin første version af Det Nye Testamente på græsk – den første trykte udgave af De Kristne Græske Skrifter der nogensinde var udkommet. Værket indeholdt noter samt hans egen oversættelse af De Kristne Græske Skrifter til latin, og den adskilte sig fra Vulgata. I tiden derefter reviderede han sin oversættelse, og det færdige resultat adskilte sig endnu mere markant fra teksten i Vulgata.

En af forskellene kunne man se i 1 Johannes 5:7. For at støtte treenighedslæren, der er ubibelsk, havde man tilføjet en misvisende sætning kendt som comma johanneum til teksten i Vulgata. Sætningen lyder: “I Himlen: Faderen og Ordet og Ånden, og de tre er ét i Kristus Jesus.” Erasmus udelod disse ord fra sine to første udgaver af Det Nye Testamente fordi de ikke forekom i de græske håndskrifter han havde undersøgt. Senere pressede kirken ham til at tage dem med i sin tredje udgave.

Reviderede udgaver af Erasmus’ udarbejdelse af Det Nye Testamente dannede grundlag for at oversættelser til europæiske sprog blev forbedret. Martin Luther, William Tyndale, Antonio Brucioli og Francisco de Enzinas brugte dem da de oversatte De Græske Skrifter til henholdsvis tysk, engelsk, italiensk og spansk.

Erasmus levede i en periode med store religiøse omvæltninger, og hans udgave af Det Nye Testamente var en uvurderlig hjælp for de protestantiske reformatorer. Nogle betragtede ham som en reformator, men det var kun indtil reformationen rent faktisk brød ud, for han nægtede at tage parti i det store teologiske opgør der fulgte. Professor David Schaff skrev interessant nok at Erasmus “døde uden noget religiøst tilhørsforhold. Katolikkerne ville ikke kendes ved ham, og protestanterne kunne ikke få ham over på deres side.”