Kis-Ázsia ny. partja mentén, az Égei-tenger egyik szigetének, Leszbosznak a legjelentősebb városa. I. sz. 56 táján, útban Jeruzsálem felé, Pál apostol Mitilénébe hajózott az attól kb. 45 km-re É-ÉNy-ra fekvő Asszoszból, a kis-ázsiai kontinens egyik tengeri kikötőjéből (Cs 20:14). Arról nem esik szó, hogy Pál leszállt volna a hajóról, tehát ez azt mutathatja, hogy a hajó csak lehorgonyzott Mitilénében, talán mert lecsendesültek a szükséges é. szelek. Másnap folytatták útjukat d-dny. irányban, Kiosz felé (Cs 20:15).

Állítólag Mitiléne eredetileg egy kis szigeten épült Leszbosz k. partja mentén. De ahogy a város növekedett, vélhetően egy töltéssel összekötötték Leszbosz szigetével, majd a part mentén terjeszkedett tovább. Így jöhetett létre a töltés mindkét oldalán egy-egy kikötő: az északi és a déli. A város neves irodalmi székhely volt, emellett híressé tették építészeti remekművei.