Principalul oraș de pe insula Lesbos, aflată în Marea Egee, în largul coastei de vest a Asiei Mici. Apostolul Pavel a ajuns la Mitilene în jurul anului 56 e.n., în timp ce călătorea cu corabia spre Ierusalim. El a venit de la Asos, port situat pe coasta Asiei Mici, la circa 45 km N-N-V de Mitilene (Fa 20:14). Întrucât nu se menționează că Pavel a debarcat la Mitilene, s-ar putea înțelege că vasul doar a aruncat ancora; vasul a făcut o oprire aici probabil deoarece vânturile de nord, necesare navigării, scăzuseră în intensitate. Ziua următoare, corabia și-a continuat drumul spre S-S-V, spre Chios (Fa 20:15).

Se crede că orașul Mitilene ocupa inițial o mică insulă aflată în apropiere de coasta estică a insulei Lesbos, dar că, după ce s-a dezvoltat, a fost legat printr-un dig de Lesbos și s-a extins de-a lungul coastei. Astfel s-ar fi format două porturi: unul pe partea de nord a digului, iar altul pe partea de sud. Mitilene a fost un centru cultural cunoscut și un oraș renumit pentru frumusețea arhitecturală a edificiilor sale.